Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной диагностики, ставший для многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы. Специфичность ПЦР для вирусных, хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии.ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю. Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры — это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис.1. 

Амплификация схема 

Амплификация схема

Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100 град. С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые «стартовые» участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент — Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100град.С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция ПЦР. В результате такого «тиражирования» за 2-3 часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такого количества ДНК достаточно, чтобы визуально регистрировать с помощью простых приемов, которые давно используются молекулярными биологами. Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) оказал революционное влияние на генодиагностику. Для использования метода необходимо знать последовательность нуклеотидов на исследуемом участке ДНК. Поскольку ДНК-полимераза не способна сама начать репликацию и может только достраивать комплементарную цепь к уже имеющемуся двухцепочечному участку, то сначала синтезируют два олигонуклеотида (так называемых праймера), комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, обычно отстоящих друг от друга на несколько сотен пар нуклеотидов. Праймеры инкубируют с ДНК, намеченной для амплификации, и ДНК-полимеразой, которая, как известно, синтезирует комплементарные цепи в направлении 5′-3′. Специфичность реакции зависит от правильного выбора праймеров. В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов по С происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов по С — присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса по С — синтез цепей ДНК. В реакции используют термостойкую ДНК-полимеразу, которая не теряет активности в течение всей процедуры. После ряда таких циклов, обычно 20-30 и более, образуются сотни тысяч копий исходной последовательности, расположенной между праймерами. Метод настолько чувствителен, что его можно использовать, например, для амплификации и анализа единственного участка ДНК из одного сперматозоида человека. Для ПЦР пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный, что позволяет исследовать цельную кровь, пятна высохшей крови, смывы из ротовой полости, старые срезы ткани и другие образцы. Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК, которую затем используют в ПЦР, — так называемый метод ПЦР с обратной транскрипцией. Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

  • расщепления рестриктазами;
  • гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;
  • определения нуклеотидной последовательности;
  • исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.

Различные модификации метода применяются для:

  • синтеза одноцепочечной ДНК путем изменения соотношения олигонуклеотидных праймеров;
  • создания рекомбинантных ДНК;
  • исследования мутагенеза клонированной ДНК;
  • сравнения экспрессии разных аллелей;
  • выявления редких нуклеотидных последовательностей или ДНК возбудителей инфекции.

ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична. Принцип ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов. Для определения продукта реакции, как правило, проводят электрофоретическую детекцию продуктов ПЦР — ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением (рис. 2 Рисунок 2 –Фотография результатов электрофореза ПЦР в агарозном геле. На дорожке 1 для сравнения ДНК-маркеры молекулярного размера, представляющие собой набор двухцепочечных молекул ДНК различных длин (размеры соответствующих фрагментов подписаны слева). На дорожках 3 и 5 присутствует искомая ДНК. На дорожках 2 и 4 результат отрицательный) ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)  — В настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом электрофореза уверенно приходят флуоресцентные методы детекции продуктов амплификации. Получать и интерпретировать результаты ПЦР становится проще, быстрее и надежнее. Одним из флуоресцентных методов является метод ПЦР в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Графики флуоресценции

Графики флуоресценции

1.   В состав реакционной смеси наряду с праймерами и остальными компонентами реакции добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя. На 3’-конце зонда находится флуоресцентная молекула – флуорофор, а на 5’-конце расположена молекула-“гаситель” флуоресценции. За счет близости флуорофора и “гасителя” вся энергия, поглощенная флуорофором, переходит на “гаситель” по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии. При этом сигнал флуоресценции отсутствует. 2.   В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК возбудителя, и зонд наряду с праймерами гибридизуется с комплементарным участком ДНК. 3.   В процессе синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимераза расщепляет этот зонд. При расщеплении зонда флуорофор отделяется от “гасителя”, расстояние между ними увеличивается, процесс тушения флуоресценции становится невозможным. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флуорофора.

График флуоресценции 

График флуоресценции

В результате такого принципа неспецифическая амплификация не обнаруживается. ПЦР “в реальном времени” имеет ряд значительных преимуществ:

  • Объединение этапов амплификации и детекции результатов. Появляется возможность оценить кинетику процесса, которая зависит от начального количества исследуемого материала
  • Существенное снижение риска контаминации и ошибок при анализе результатов
  • Высокая специфичность реакции за счет использования высокоспецифичных флуоресцентных зондов.
  • Высокая производительность
  • Снижение субъективности оценки результатов
  • Упрощение требований к организации ПЦР-лаборатории
  • Возможность количественной оценки исходной ДНК матрицы
  • Регистрация и учет данных в электронном формате

ПЦР “в реальном времени” характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице. Для проведения анализа необходим специальный прибор -амплификатор для ПЦР в реальном времени, который совмещает в себе функции термоциклера и флуоресцентного детектора (iCycler iQ5, CFX96 (Bio-Rad); ДТ-322, ДТ-96 (ДНК-Технология); Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000, Rotor-Gene Q ( Corbett Research/Qiagen); Cobas TagMan48 (Roche)и др. (рис. 3 Rotor-Gene Q) Программное обеспечение таких приборов позволяет сопоставлять кинетику реакции в исследуемых и стандартных образцах и вычислять концентрацию исходной матрицы ДНК (в присутствии стандартных образцов с известной концентрацией анализируемой ДНК) (рис. 4). При выявлении ДНК возбудителей инфекционных заболеваний целесообразно использовать данный метод в количественной оценке только тех инфекционных агентов, количественное содержание которых в анализируемом образце действительно имеет клиническую значимость. Определение количественных характеристик инфекции позволяет судить о динамике и стадии заболевания, а также об эффективности проводимой терапии. Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе. Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии. Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.Панлейкопения — контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят). lamsystemsНастоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами. При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы. При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз. Аденовирус плотоядных. Возбудитель — ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения. Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.shemaТоксоплазмоз. Возбудитель — простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты. Промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. У кошек развитие паразита в кишечнике обычно проходит бессимптомно, изредка вызывая «легкий» понос. Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит. Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек — Chlamydophila felts, у собак — Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц — Ch. psittaci. У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак. Микоплазмоз. Возбудители — микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов. Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек — тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции. Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.shema_2Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство. Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата. Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия. И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с, ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН

1 2 1 3  4 5  6

Обратная связь

Ваше письмо отправлено!

Спасибо за ваше обращение

© 2011-2018  ГБУВ МО "Территориальное ветеринарное управление № 4"

142701, Московская область, г.Видное, Проспект Ленинского комсомола, д. 1-В

Тел. +7 (499) 7000-233

Skype